Última alteração: 2021-02-25
Resumo
A cultura de tecidos vegetais é uma técnica biotecnológica empregada em programas de melhoramento genético de cana-de-açúcar na obtenção in vitro de plantas sadias com características de interesse comercial. Uma das vias de regeneração mais utilizadas na cultura de tecidos de cana-de-açúcar é a embriogênese somática indireta (ESI), a qual produz massas de células desdiferenciadas (calos) que podem ser utilizadas como material vegetal em eventos de transformação genética. Uma das famílias gênicas responsáveis pela regulação da ESI é a Wuschel-related homebox, a qual possui genes WUSCHEL (WUS) que promovem a formação e desenvolvimento de tecido embriogênico. A identificação de genes WUS já foi realizada em diversas espécies vegetais, entretanto existem poucos estudos que identifiquem esses genes no genoma da cana-de-açúcar. Desse modo, o presente trabalho objetivou identificar sequências putativas de WUS em cana-de-açúcar e quantificar sua expressão gênica em calos embriogênicos durante 7, 14 e 40 dias de cultivo in vitro. Para a coleta de material vegetal, foram realizadas introduções in vitro de discos foliares da variedade comercial SP80-3280 de cana-de-açúcar em meio de cultura MS3K. Na análise in silico foram utilizadas como base de consulta, sequências de aminoácidos e nucleotídeos de genes WUS de espécies de gramíneas e Arabidopsis thaliana para encontrar sequências homólogas em cana-de-açúcar (SP80-3280 e S. spontaneum) depositadas no banco de dados do SUCEST-FUN. Todas as sequências proteicas de cana-de-açúcar e demais espécies foram alinhadas com o auxílio do software CLUSTALW para posterior construção de uma árvore filogenética do tipo neighbor-joining. As sequências de nucleotídeos de cana-de-açúcar foram inseridas no software PRIMER3 para a obtenção de pares de primers ideais para estudos de expressão gênica, os quais foram avaliados através do software Beacon Designer e amplificação via PCR convencional. Cerca de 70% dos discos foliares foram responsivos à calogênese, sendo que 82,6% desses discos formaram calos embriogênicos. Nas análises in silico, foram obtidas 14 sequências putativas de aminoácidos de WUS em cana-de-açúcar e 17 pares de primers possíveis de serem usados em reações de qPCR. A filogenia apontou que as proteínas putativas de cana-de-açúcar possuem proximidade com proteínas WUS de sorgo e milho, sugerindo que tais sequências são conservadas ao longo da evolução. O presente estudo sugere que podem existir mais de um gene WUS regulando as vias da ESI em cana-de-açúcar. Além disso, a identificação de genes WUS em cana-de-açúcar pode auxiliar no desenvolvimento de marcadores moleculares capazes de detectar genótipos não recalcitrantes in vitro. Adicionalmente, os presentes achados fornecem subsídio para estudos que almejam aumentar o potencial embriogênico de variedades comerciais através de técnicas de edição de genomas.
Palavras-chave
Referências
BHOJWANI, S. S.; DANTU, P. K. Somatic Embryogenesis. In: Plant Tissue Culture: An Introductory Text. Springer, India. 2013.CHANDLER, J.; NARDMANN, J.; WERR, W. Plant development revolves around axes. Trends in Plant Science, v.13, p. 78 – 84, 2008.
BURRIEZA, H. P. et al. Accumulation pattern of dehydrins during sugarcane (var. SP80. 3280) somatic embryogenesis. Plant cell reports, v. 31, n. 12, p. 2139-2149, 2012.
CHEAVEGATTI GIANOTTO, A. et al. Sugarcane (Saccharum officinarum): a reference study for the regulation of genetically modified cultivars in Brazil. Tropical Plant Biology, Kunia, USA, v.4, p. 62-89, 2011.
DANIELS, J.; ROACH, B. T. Taxonomy and evolution. In: HEINZ, D. J.(ed) Sugarcane improvement through breeding. Amsterdam: Elsevier, 1987, p. 7-84.
DONG, J.-Z.; DUNSTAN, D. I. Molecular biology of somatic embryogenesis in conifers. In: JAIN, S. M.; MINOCHA, S. C. (eds.). Molecular biology of woody plants. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, v. 1, p. 51-87, 2000.
DOYLE, J. J; DOYLE, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small amounts offresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, v. 19, p.11–15, 1987.
ELHITI, M.; STASOLLA, C.; WANG, A. Molecular regulation of plant somatic embryogenesis. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, v. 49, ed. 6, p. 631- 642, 2013.FERRARI, I. F. Caracterização anatômica e molecular da embriogênese somática direta e indireta de Coffea arabica. Tese (Doutorado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia. Campinas. p. 74. 2016.
GANDONOU, C. H. et al. Effect of genotype on callus induction and plant regeneration from leaf explants of sugarcane (Saccharum sp.). African Journal of Biotechnology, v. 4, n. 11, 2005.
GEORGE, E. F. Plant propagation by tissue culture: part 1: the technology. Edington: Exegetics, p.574, 1996.
GUIMARÃES, C. T.; SILLS, G. R.; SOBRAL, B. W. S. Comparative mapping of Andropogoneae: Saccharum L. (sugarcane) and its relation to sorghum and maize. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 94, n. 26, p. 14261-14266, 1997.
HAECKER, A.; GROß-HARDT, R.; GEIGES, B.; SARKAR, A.; BREUNINGER, H.; HERRMANN, M.; LAUX, T. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development, v. 131, p. 65–668, 2004.
MING, R.; LIU, S.; LIN, Y.; SILVA, J.; WILSON, W.; BRAGA, D.; DEYNZE, A.; WENSLAFF, T. F.; WU, K.K.; MOORE, P. H.; BURNQUIST, W.; SORRELLS, M. E.; IRVINE, J. E.; PATERSON, A. H.. Detailed Alignment of Saccharum and Sorghum Chromosomes: Comparative Organization of Closely Related Diploid and Polyploid Genomes. Genetics, vol. 150, n. 4, p. 1663-1682, 1998.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, v. 15, p. 473-497, 1962.
NOGUEIRA, R.C.; PAIVA, R.; OLIVEIRA, L. M.; SOARES, G. A.; SOARES, F. P.; CASTRO, A. H. F.; PAIVA, P. D. O. Indução de calos em explantes foliares de Murici-pequeno (Byrsonima intermedia A. Juss.). Ciência e Agrotecnologia, n. 31, v. 2, p. 366-370,2007.
PAN, Y.; LIU, P.; QUE, Y. Independently Segregating Simple Sequence Repeats (SSR) Alleles in Polyploid Sugarcane. Sugar Tech, v. 17, ed. 3, p. 235-242, 2015.
PARK, J. W.; SILVA, J. A. Hybridization of sugarcane and other grasses for novel traits. In: LAM, E.; CARRER, H. SILVA, J. A.; KOLE, C. Compendium of bioenergy plants. Boca Raton: CRC Press, 2016. Cap. 1, p. 15-30.
SILVEIRA, V.; VITA, A. M.; MACEDO, A. F.; DIAS, M. F. R.; FLOH, E. I. S.; SANTACATARINA, C. Morphological and polyamine content changes in embryogenic and non-embryogenic callus of sugarcane. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v.114, e.3, p.351-364, 2013.
SIMOES, C.; ALBARELLO, N.; CALLADO, C. H.; CASTRO, T. C.; MANSUR, E. Somatic embryogenesis and plant regeneration from callus cultures of Cleome rosea Vahl. Brazilian Archives of Biology and Technology, v. 53, n.3, p.679-686, 2010.
SHIVANI; A, P.; SHARMA, V.; KAUR, N.; KAUR, N.; PANDEY, P.; TIWARI, S. Genome-wide analysis of transcription factors during somatic embryogenesis in banana (Musa spp.) cv. Grand Naine. PLoS One, v.12, e182242, 2017.
SOLÍS-RAMOS, L.Y., GONZÁLEZ-ESTRADA, T., NAHUATH-DZIB, S. et al. Overexpression of WUSCHEL in C. chinense causes ectopic morphogenesis. Plant Cell Tiss Organ Cult 96, 279–287 (2009).
SOUZA, G. M. et al. Assembly of the 373k gene space of the polyploid sugarcane genome reveals reservoirs of functional diversity in the world's leading biomass crop. GigaScience, v. 8, n. 12, p. giz129, 2019.
SOUZA, I. P. Introdução. In: SOUZA, I. P. OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PRELIMINAR DE UM DRAFT ASSEMBLY DO GENOMA DE CANA-DE-AÇÚCAR (Saccharum spp.). Orientador: Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho. 2019. Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas) - Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2019. f. 88.
SÖNDAHL, M. R.; NAKAMURA, T.; SHARP, W. R. In: HENKE, R. R.; HUGHES, K. W.; CONSTANTIN, M. P.; HOLLAENDER, A. (ed.). Tissue Culture in Forestry and Agriculture. New York: Plenum Press, p. 215-232.1985. YANG, X.; SONG, J.; YOU, Q. et al. Mining sequence variations in representative polyploid sugarcane germplasm accessions. BMC Genomics, v. 18, p. 594, 2017.
ZUO, J.; NIU, Q.-W.; FRUGIS, G.; CHUA, N.-H. The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis. The Plant Journal, v. 30, n.3, p. 349–359, 2002.