1.   Introdução

A enzima β-glicosidase é uma celulase, que atua em sinergia com outras enzimas do complexo celulolítico, convertendo a celobiose em moléculas de glicose. Foi identificada recentemente por nosso grupo de pesquisa no transcriptoma de cupins da espécie Heterotermes tenuis, o que torna esses insetos importantes alvos de bioprospecção enzimática.

2.   Objetivo

Clonagem, expressão heteróloga e caracterização da enzima β-glicosidase presente em cupins da espécie Heterotermes tenuis, visando sua aplicação na produção de etanol de segunda geração.

3.   METODOLOGIA

3.1. Análises in silico

As análises foram realizadas por meio de ferramentas on-line de bioinformática, a partir da sequência de aminoácidos em formato FASTA. Os softwares utilizados nas predições foram UCL-CS Bioinformatics, Phyre2 e YinOYang 1.2.

3.2. Extração de RNA dos cupins e transformação em cDNA

Os cupins foram pulverizados em nitrogênio líquido e o RNA foi extraído com o reagente Trizol® (Invitrogen), 100 ng de RNA de cada amostra foram utilizados para a síntese de cDNA, com uso de SuperScript™ III Reverse Transcriptase (Thermo Fisher). Os protocolos seguiram as instruções do fabricante.

3.3. Amplificação da sequência

Baseado na sequência do transcriptoma, iniciadores foram desenhados visando a amplificação da sequência codificante, obtida utilizando a enzima Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/L) (Thermo Fisher), seguindo as instruções do fabricante. A verificação da amplificação foi realizada por eletroforese em gel de agarose 1%.

4. RESULTADOS

4.1. Análises in silico

As análises in silico mostraram que a proteína possui uma estrutura formada em sua maioria por alfa hélices e folhas beta, com maioria de regiões hidrofóbicas e com uma porção de interação com a membrana celular. Adicionalmente, para seu correto dobramento, essa proteína apresenta uma alta taxa de glicosilação, sugerindo que a expressão em organismos eucariotos poderia ser a melhor escolha para se obter a proteína solúvel e funcional.

4.2. Síntese de cDNA e amplificação da região codificante da enzima β-glicosidase

A integridade do RNA extraído foi verificada por eletroforese em gel desnaturante de agarose, que evidenciou o aparecimento dos fragmentos das subunidades ribossomais. Adicionalmente à correta síntese de cDNA, foi realizada uma amplificação de um fragmento do gene codificante para a proteína β-actina, uma vez que este é um gene de expressão constitutiva nesse inseto. Após a comprovação da eficiência da síntese, os iniciadores desenhados com base no transcriptoma foram utilizados em uma reação em cadeia da polimerase (PCR), para a amplificação da região codificante do gene da enzima β-glicosidase. Após a eletroforese, foi constatada a amplificação do fragmento do tamanho esperado (1488 pb). Este fragmento encontra-se em fase de clonagem no vetor PpicZa, para expressão heteróloga na levedura Picchia pastoris. Em seguida, experimentos de caracterização da atividade enzimática serão realizados, visando a comparação com outras enzimas já descritas na literatura.

5. Conclusão

A caracterização in silico da enzima possibilitou o conhecimento de sua possível estrutura tridimensional e modificações pós-traducionais. Com a obtenção da região codificante da proteína, espera-se, dando continuidade aos experimentos, obter uma proteína solúvel e funcional, expressa em um organismo eucarioto, a qual poderá ser utilizada para fins biotecnológicos.