O cancro cítrico é uma doença causada pela bactéria do gênero Xanthomonas e, por não possuir cura ou medidas de controle eficazes, acarreta em grandes prejuízos para a citricultura brasileira. Em uma análise proteômica de superfície realizada anteriormente em nosso grupo de pesquisa em Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) foi identificada a chaperona DnaK em maior quantidade em condições infectantes (interação com a planta, in vivo) do que em condições não infectantes (meio CN não indutor de patogenicidade, in vitro). A DnaK já foi relatada como estando em superfícies celulares de outras espécies bacterianas patogênicas. Previamente a DnaK de Xac foi expressa em nosso grupo na forma heteróloga e purificada para a produção de anticorpos policlonais em camundongos, os quais foram aqui utilizados. O objetivo deste trabalho foi comprovar a localização superficial da DnaK em Xac e sua possível relação com a patogenicidade. Para isto foram realizados experimentos de Western Blot em células cultivadas em meio CN ou in vivo (folhas de limão-galego), além de ensaios de formação de biofilme, microscopia confocal de fluorescência e ELISA, nos quais as células foram crescidas em CN ou XAM-M (meio indutor de patogenicidade). Para o Western Blot, as células de Xac foram colocadas em contato com anticorpos anti-DnaK e os anticorpos residuais não ligados à superfície celular foram detectados por Western Blot contra a proteína DnaK recombinante produzida neste trabalho a partir de clone disponível (gene da DnaK de Xac clonado em vetor pET). Os resultados não foram satisfatórios apesar de se ter notado sutil diferença da quantidade de anticorpos em relação ao controle (concentração de anticorpos antes de ser colocado em contato com as células). O ensaio de biofilme foi feito em microplaca com as células na presença de diluições decrescentes dos anticorpos anti-DnaK sendo o biofilme medido em 24, 48 e 72 horas após coloração com cristal violeta e medida da D.O. a 595 nm. O resultado mostrou que a DnaK deve estar na superfície de Xac e envolvida na formação de biofilme uma vez que o aumento de anticorpos anti-DnaK interferiu de maneira crescente na sua formação. A microscopia confocal de fluorescência foi realizada para identificação visual diferencial de DnaK superficial em Xac, adicionando-se anticorpos anti-DnaK e anticorpos secundários anti-IgG de coelho conjugados com fluorescein isothiocyanate (FITC). Os resultados mostraram diferença significativa de DnaK superficial entre as condições testadas. Para realização do ELISA, assim como o Western Blot, os anticorpos anti-DnaK residuais do contato com as células, diluídos 1:100, 1:1000 e 1:10000, foram quantificados por reação em placa com a DnaK recombinante imobilizada.  O ensaio de ELISA não foi sensível quanto o esperado ou não houve diferença significativa entre as condições. Acredita-se que as condições do teste de ELISA e do Western Blot possam ainda ser otimizados, o que não foi possível devido ao isolamento ocasionado pela Pandemia do COVID-19. Já os resultados da microscopia e do ensaio de biofilme indicam tanto a presença de DnaK na superfície celular como também diferenças na sua abundância na célula infecciosa relativamente à célula não infecciosa. Posterior ensaio será realizado de citometria de fluxo para comprovar esses resultados. Em conclusão, os resultados apontam para a presença da chaperona DnaK na superfície de Xac  e também para o seu  envolvimento com a formação de biofilme, aspecto este relacionado com a sua patogenicidade.

Agradecimentos: À FAPESP (Proc. 07/50910-2) – Proj. Jovem Pesquisador, ao IFSC – USP São Carlos pela utilização do microscópio confocal - Projeto FAPESP 2009/54035-4, ao grupo do Laboratório de Bioquímica Funcional e Estrutural (LBFE/DQ/UFSCar) da profa. Dra. Dulce Helena Ferreira de Souza, ao grupo do laboratório de Inflamação e Doenças Infecciosas (LIDI/DMP/UFScar) da profa. Dra. Fernanda de Freitas Anibal.