INTRODUÇÃO: As luciferases de vagalumes lampirídeos emitem luz na região do verde-amarelo e seus espectros são sensíveis ao pH e metais pesados. Nas ultimas décadas tem sido intensivamente usadas em bioanálises de ATP, viabilidade celular, ensaios enzimáticos, e posteriormente seus genes tem sido empregados como os genes repórter mais populares para estudar expressão gênica, biossensores e bioimagem. Recentemente, nosso grupo identificou o sitio de ligação de metais e o mecanismo de sensibilidade ao pH nestas luciferases (Viviani et al., 2018), permitindo a modificação dos sítios de ligação e iniciar a desenvolver luciferases com diferentes sensibilidades espectrais a diferentes metais. A luciferase de Amydetes vivianii é a luciferase com o espectro mais deslocado para o azul (548 nm) entre as luciferases pH-sensitivas, exibindo uma menor sensibilidade ao pH, e sensibilidade seletiva para os metais cádmio e mercúrio. Por esta razão esta enzima constitui um bom substrato para desenvolver luciferase sensora de metais e pH. OBJETIVOS: Através de mutagênese sítio-dirigida, investigar a influência do resíduo H310, na sensibilidade ao pH e a diferentes metais como Cadmio e mercúrio, e as cinéticas dos mutantes. METODOLOGIA: Realizou-se mutagênese sítio-dirigida no cDNA de Amydetes vivianii utilizado o Kit “Phusion High Fidelity DNA Polymerase” (Thermo Scientific) segundo o protocolo do fornecedor. Células BL-21 foram transformadas com plasmídeo pCold-Amy e crescidas em meio LB acrescido de ampicilina e IPTG a 18ºC a overnight. O extrato bruto foi purificado por cromatografia de afinidade usando resinas de níquel-agarose (Qiagen). A intensidade luminosa foi medida usando o luminômetro AB2200 (ATTO, Tokyo) em counts por segundo (cps). O espectro de bioluminescência foi medido no espectroluminomêtro ATTO Lumispectra (Tokyo, Japan). Os valores de K_M foram calculados plotando os inversos de atividade luminescente x concentrações de substratos em gráfico de Lineweaver-Burk. O pH ótimo foi determinado pela medição das atividades em tampões em diferentes pHs. A sensibilidade espectral aos metais foi definida pela medição das atividades e espectros de bioluminescência na presença dos mesmos. RESULTADOS: Foram obtidos os mutantes H310E, H310D, H310T e H310Q. Com exceção do H310T, houve um decréscimo na atividade específica dos mutantes. Em pH 8,0, os espectros de bioluminescências foram parecidos ao da luciferase selvagem (548 nm), já em pH 6,0, a maioria dos mutantes, com exceção de H310T exibiram  um deslocamento espectral mais acentuado para a região do vermelho (603 nm). Com exceção do mutante H310T, os outros mutantes mostraram sensibilidade espectral aumentada a uma gama maior de metais tóxicos e pesados. CONCLUSÃO: Os resultados confirmam a importância da posição 310 na especificidade da enzima por metais. Os resultados sugerem que a substituição da H310 por outros resíduos nesta posição alteram o padrão de carga,  a ponte salina com o resíduo E354 e o tamanho da cavidade afetando a interação e afinidade por diferentes metais.

Processo FAPESP: (2018/26151-9);  Processo CNPq: 401867/2016-1